编者按：2022年5月20日，天津医科大学石磊课题组和张锴课题组在Molecular Cell杂志（影响因子17.9，JCR1区）上合作发表了题为“A PARylation-phosphorylation cascade promotes TOPBP1 loading and RPA-RAD51 exchange in homologous recombination”的研究成果，该研究对乳腺癌患者的同源重组修复调控模式进行了介绍。《肿瘤瞭望》特邀中国医学科大学附属第一医院毛晓韵教授对该项研究内容和临床应用价值进行了介绍，并对研究带来的启示做出了展望。

 

 

天津医科大学石磊教授

 

 

研究背景：基因组不稳定性是肿瘤的重要特征之一。基因组稳定性的维持依赖细胞利用不同的修复途径感知和修复DNA损伤。DNA双链断裂是最为严重的损伤形式，修复不当可以导致染色体断裂、异位或缺失。其中，同源重组（Homologous recombination，HR）是修复DNA双链断裂（Double-strand breaks，DSBs）的高保真途径，不仅在基因组稳定性维持中发挥重要作用，也与肿瘤发生发展和放化疗敏感性密切相关。BRCA1/2作为重要的HR调节因子，它们的突变或功能缺失与乳腺癌和卵巢癌密切相关。临床上，这类肿瘤已经成为PARP抑制剂的重要靶向类型，但治疗过程中经常伴随HR的重新获得。同时，大部分非BRCA突变肿瘤的HR活性本身就是完整的。因此深刻理解HR的调控机理和靶向相应途径，有助于我们更好的理解乳腺癌等肿瘤的发病机制，并在治疗或克服PARP耐药上提供新的策略。

 

研究设计：RPA和RAD51在单链DNA上的置换是HR修复的重要环节，然而这一过程是如何调控的尚缺乏研究。TOPBP1是重要的HR调节因子，但是TOPBP1如何识别HR倾向性的损伤染色质，还有待研究。该研究从探索TOPBP1如何识别HR倾向性断裂位点入手，在鉴定到可以调节TOPBP1募集因子的基础上，建立偶联RPA-RAD51交换的调控模型。

 

研究结果：为了研究TOPBP1促进的HR修复是如何调控的，我们首先对其不同BRCT结构域上的关键氨基酸进行突变分析，发现K250主要调控TOPBP1在S-G2期损伤位点积累，进一步通过质谱鉴定发现HTATSF1是S期TOPBP1结合蛋白（图1）。

 

图1. HTATSF1是S期TOPBP1结合蛋白

 

1、为了进一步了解HTATSF1-TOPBP1相互作用的分子机理，我们通过Co-IP，SPR实验等发现HTATSF1通过pS748负责与TOPBP1结合（图2）。

 

图2. HTATSF1通过pS748与TOPBP1结合

 

2、接下来我们想探究是什么激酶促进了HTATSF1 S748的磷酸化，通过序列比对发现ECT motif符合CK2磷酸化的Ser/Thr-X-X-Asp/Glu基序，体外磷酸化实验证明CK2能够促进S748的磷酸化，而其抑制剂CX-4945有效抑制了该效果（图3）。

 

图3. CK2促进HTATSF1 S748磷酸化

 

3、为了探究HTATSF1是否会影响TOPBP1在DSB处的募集，我们通过敲低HTATSF1发现S期TOPBP1在损伤位点的积累减少，同时发现HTATSF1是通过S748位点调控TOPBP1的积累（图4）。

 

图4. CK2催化的HTATSF1 S748磷酸化促进S期TOPBP1的积累

 

4、接下来，我们研究了HTATSF1-TOPBP1结合是否在同源重组修复中发挥作用，通过HR reporter实验发现HTATSF1敲低或突变（S748A）均会导致HR修复效率降低，并且我们发现HTATSF1能够有效的调控RPA-RAD51交换（图5）。

 

 

5、为了进一步探究HTATSF1如何控制TOPBP1在DSB处募集的，我们发现PARPi抑制了HTATSF1的募集，同时研究发现其RRMs结构域通过识别PAR促进HTATSF1在DSB处募集进而影响TOPBP1的积累（图6）。

 

图6. HTATSF1 RRMs介导的PAR结合促进HTATSF1-TOPBP1复合物募集

 

6、鉴于HTATSF1-TOPBP1复合物不影响RPA在损伤位点的积累但促进了RAD51的募集，因此我们猜测RPA的PAR修饰可能促进HTATSF1-TOPBP1复合募集到DSB位点，我们敲低RPA后发现HTATSF1在损伤位点的积累减少。PLA实验证明PARPi以及HTATSF1 RRMs的突变体（4A）抑制RPA与HTATSF1的结合，从而导致TOPBP1以及下游的RAD51在染色质上的沉积（图7）。

 

图7. RPA PARylation决定HTATSF1-TOPBP1复合物的加载和RPA-RAD51交换

 

 

同源重组（homologous recombination， HR）修复晚期，ssDNA上结合的RPA需要被RAD51分子替换以完成同源模板搜索。该过程中，RPA与RAD51之间的联系是如何建立的，是领域内关注的重要科学问题之一。该研究发现：染色质结合因子HTATSF1与DNA损伤修复因子TOPBP1组成CK2激酶依赖性复合物，该复合物通过HTATSF1的RRMs（RNA recognition motifs）识别RPA分子的PARylation（poly ADP-ribosylation）修饰。在DNA末端剪切后的ssDNA-RPA平台上，HTATSF1-TOPBP1复合物通过活化PLK1激酶促进RAD51沉积和RPA分子的替换，最终完成HR修复过程。总体来说，该研究一方面揭示了RPA-RAD51交换过程中的负反馈调节是如何建立的以及HR修复过程中TOPBP1如何识别损伤染色质，另一方面基于TOPBP1在基因组稳定性维持中的重要作用，为基于靶向HR的肿瘤治疗提供了新的靶点。

 

 

科学问题的提出和凝练：作为重要的基因组稳定性维持因子，TOPBP1在DNA复制、复制压力应答和损伤修复过程中发挥重要作用。TOPBP1作为一个支架蛋白不能直接识别染色质，而是需要借助其BRCT结构域完成。该研究从探索HR修复的染色质环境下TOPBP1是如何招募的这一科学问题入手，进而通过HTATSF1-TOPBP1复合物建立了RPA-RAD51置换的模型，为RPA的卸载和RAD51装配这一偶联过程提供了新的认识。在解决小问题的基础上（TOPBP1募集），回答了领域内比较关注的重要科学问题（RPA-RAD51交换）。

 

研究策略和技术手段：该研究利用FUCCI细胞检测TOPBP1在不同细胞周期的募集，进而鉴定S-G2期TOPBP1的相互作用蛋白，该研究还使用了SPR这一生物物理手段研究翻译后修饰和蛋白质的相互作用。通过一系列常规的研究策略组合，达到了解决重要科学问题的目的。

 

毛晓韵

中国医科大学附属一院乳腺外科

教授、主任医师 硕士生研究生导师

中国抗癌协会乳腺癌专业委员会青年专家

中华医学会肿瘤学分会乳腺肿瘤青年学组委员

中国抗癌协会肿瘤精准治疗专业委员会青年专家